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內容簡介

《核酸適配體手冊》全書圍繞功能性寡核苷酸及其應用，系統介紹了核酸適配體的體外篩選原理、技術方法以及近年來在基礎醫學、臨床診斷、藥物研究等方面的應用。主要包括各種靶分子的適配體體外篩選技術；用核酸適配體作為藥理探針在體內和體外確定靶標、蛋白功能分析、活體成像和適配體在臨床治療研究中的應用等。書中內容均為該領域研究成果，其介紹的內容和方法對于國內適配體研究工作者具有指導意義和良好參考價值。

編輯推薦

《核酸適配體手冊》以功能性寡核苷酸及其應用為核心，系統介紹了核酸適配體的體外篩選原理、技術方法以及近年來在基礎醫學、臨床診斷、藥物研究等方面的應用。本書姊妹篇《生物分析中的適配體》于2011年出版后，受到業內讀者的廣泛好評。這兩本書的出版著重于適配體在生物分析化學中的應用。

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作者簡介

譯者：屈鋒，北京理工大學，教授，研究方向為生物醫學分析檢測和生物分離。研究內容涉及：蛋白質與核酸分析及相互作用；核酸適配體篩選；蛋白質組學分析方法；細胞活性分析及毒性物質評價；微生物特性及分析檢測。主持和承擔科研項目：973《蛋白質分析鑒定新技術與新方法》；科技部"十一五"科技支撐計劃《高通量蛋白質分離檢測系統的研制與開發》；國家自然科學基金面上項目《基于模式病原菌全細胞核酸適配體的毛細管電泳篩選方法研究》等。

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16.1.2 成像的要求

與小分子、肽和抗體片段一樣，適配體是分子成像中有前景的工具。研究中，適配體已成功用于核酸和蛋白質分子靶標。與具有對靶標的高特異性和親和性一樣，合適的化學穩定性，快速的藥代動力學，無免疫原性和毒副作用也是適配體作為有效的成像試劑的先決條件。正如已經在"escort"適配體概念中所描述的那樣，為了盡早獲得高信噪比，快速的組織滲透和對靶標的高親和結合是排在首位的要求(Hicke 等，2000)。

與干預治療相比，成像中不需在疾病過程中直接干涉，如活化或抑制酶或其他信號通路。疾病器官或組織中的放射標記靶試劑的積累，能僅通過結合以及通過腎或肝膽排泄去除未結合的部分后發生。總之，快速的組織滲透和靶向累積結合快速排泄是SPECT和PET應用的材料，主要使用半衰期短的同位素，如SPECT中的99mTc(t1/2=6 h)和PET中的18F(t1/2=2 h)。因此，在常規的核醫學診斷中，需要盡早時間點的高信噪比。這方面的重要參數是指腫瘤與血液之比高，腫瘤與正常組織之比高，出現的尿液排泄比肝膽清除快(表16.2，癌癥放射診斷中體內靶標示蹤劑的性能)。相對于治療應用，診斷成像中，靶位處的高濃度的放射標性記的適配體不如高信噪比更重要，因為當健康器官和組織中的示蹤劑消除快速發生時，低濃度的示蹤劑甚至可通過疾病器官自身吸收而獲得高信噪比。

16.2 體內成像用適配體

16.2.1體內應用的寡核苷酸性質

利用SELEX過程已經產生了一些受人關注的靶標的適配體，它們具備很有前途的體外特性。然而，目前只有少量的成功用于體內成像實驗的適配體的報道。因為通常不可能根據寡核苷酸和其它靶標試劑的體外數據進行體內情況的推斷，所以在放射標記后研究寡核苷酸的生物分布和成像特點是表征它們體內行為的有益方法，這也與利用寡核苷酸作為藥物開發的工具以及開發寡核苷酸藥物本身有關。

兩個關鍵的性質-在生物體液中的穩定性和系統性的清除-決定了適配體的生物利用度。開發這類化合物作為藥物的主要障礙仍然是它們對于血漿中核酸內切酶和核酸外切酶的不穩定。適配體在血液中的快速降解阻止了它與靶的結合，導致成像中的信噪比不足。在這方面，RNA適配體被證明比DNA適配體更穩定。寡核苷酸骨架(如磷酸二酯，硫代磷酸，甲基二酯)的后SELEX修飾，或在核糖位置上引入2`-氨基，氟或甲氧基團能夠顯著提升寡核苷酸的穩定性。必需確定在適配體序列中的合適的位置進行這些后SELEX修飾，因為它們能顯著影響結合的親和性或適配體的體內性質(Schmidt 等，2004)。硫代磷酸寡核苷酸表現出對血漿蛋白的高結合性和持續的被肝臟和腎臟吸收(Tavitian等，1998)，并且發現它們的代謝物排泄進入尿液。相反，2`-甲氧基RNA或2`-氟嘧啶適配體的主要排泄完全通過腎臟。核苷酸的取代或其它修飾，如通過聚乙二醇化增加分子大小也嚴重影響體系的清除速率。此外，選擇放射性同位素(見表16.3)以及它的螯合物對放射性標記寡核苷酸的生物分布有重要的影響(Zhang等 2000和Kühnast等， 2000)。

一般用來阻止血漿中3`-核酸外切酶降解的3`-帽子(Dougan等，1997)可使適配體在血液中的穩定性顯著增加。其它欲獲得更高的體內穩定性的策略產生了合成的鏡像異構體，鎖核酸(LNAs)和肽核酸(PNAs)。由于具有更高的穩定性和可快速在體內清除，PNA是成像中最受關注的。此外，它們能被設計成具有跨細胞膜的性質(Mier等，2000)，這開啟了它們用于細胞內靶標成像的可能性(參見Tung的綜述，2000)。

盡管前面提到的一種或多種策略得到的適配體的穩定性是它們在體內應用的前提，但是不得不考慮到高的穩定性可能也導致高的背景活性，因而卻導致成像中的低信噪比。例如，適配體TTA1的LNA衍生物在經99mTC標記后已經用于體內的腫瘤靶標研究(Schmidt等，2004)。盡管更高的血漿穩定性導致小鼠內腫瘤的吸收增加，但觀察到的組織的背景增加和腎及肝膽排泄的減慢現象則導致更低的信噪比(表16.4)。此外，TTA1的2`-甲氧基和LNA骨架修飾使鼠類的生物分布向更高的尿液清除和腎臟吸收移動，而未修飾的TTA1則表現出更高的腸道吸收和更快的糞便排泄。總之，適配體的兩種關鍵性質的平衡——穩定性，允許充分的靶標定向和體內清除，以及在不含靶標的器官和組織中的低背景活性——針對每種適配體必須進行優化。快速的腎臟清除可以在用藥后很快引起非常高的信噪比，只要能夠實現特異性的分子在靶標處的滯留。

在動物中已經觀察到適配體有非特異性的吸附血清蛋白或細胞的傾向，在系統給藥后，適配體保留在非靶組織如排泄器官。適配體骨架的高負電荷似乎是這個現象的原因，因為它增加了成像過程中背景的活性。

適配體到它們的靶標的有效傳輸是它們在體內應用的另一個主要障礙，已經進行了一些提升灌注穿透內皮細胞層和提升細胞的吸收和內化的嘗試。如陽離子脂質，多胺或合成載體已經用于克服大多數寡核苷酸的高度電荷化的骨架，這可以阻止它們與細胞內的靶標結合。然而，適配體在成像中有關載體的成功應用還沒有報道。

16.2.2 不同類型的靶向試劑比較

適配體的分子量大約為10-15 kDa，介于肽和抗體片段之間。與抗體和抗體片段(scFv，Fab)相比，適配體的一些特色在成像中是優勢：

與抗體相比，由于適配體分子尺寸更小，它能更快的擴散進入組織和器官，產生更快的靶向定位(和成像)。

適配體的分子量更小，導致在體內循環時間更短，體內的清除更快，成像時背景噪音低。

快速的體內清除減小了病人的輻射劑量(全身的劑量)

適配體不會引起免疫反應

由于全部是合成的，適配體產品價格便宜

肽是比適配體更小的適配體，已經用于定位細胞表面的蛋白如G-蛋白偶聯受體。與小分子一樣，它們代表了一種有用的工具，特別是在PET成像領域。由于多數PET同位素的半衰期短，所以成像應用時需要有快速的藥代動力學。由于適配體庫的高通量篩選通過SELEX過程是可行的，以及適配體的高親和性和特異性和它們的自動合成，針對體內成像，適配體結合了抗體和肽的優勢(Hicke和Stephens, 2000)。根據它們的分子量，適配體似乎仍然是足夠小的分子，用于PET成像很有吸引力。盡管寡核苷酸似乎是合理藥物設計的非常好的工具，但它們的系統性治療藥物的使用還很少有轉換到體內的應用。產生這種情況的原因是它們固有的脆弱性、較低的生物利用度和非特異性作用的傾向(Younes 等， 2002)。與系統性的治療藥物使用的限制相反，在成像中寡核苷酸總體的適用性已經被證明，今后越來越多的特別是成像中放射標記的適配體的使用是可以預見的。

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