引論：我們為您整理了1篇分析激光技術的應用范文，供您借鑒以豐富您的創作。它們是您寫作時的寶貴資源，期望它們能夠激發您的創作靈感，讓您的文章更具深度。
分析激光技術的應用:分析激光技術在醫學上的應
摘要 主要介紹了激光全息技術和C02醫用激光的興起和在醫學領域的應用,從激光全息技術的原理到原先再現,都作了詳細的說明。對C02醫用激光器在實際工作中的具體應用和改進作了詳細介紹。
關鍵詞 全息技術;全息照相術;全息再現;C02醫用激光器
1 激光全患技術
激光全息技術是20世紀60年代初興起的一門技術。激光全息技術發展很快,已在生產和科研的許多領域中廣泛應用。把激光全息技術應用于醫學的是Van Ugten,他于1966年在世界上首次攝得眼全息圖,但限于當時的技術水平,再現像的分辨率較差。以后各國科學家相繼開始將激光全息技術應用于醫學領域,從眼科擴展至胸外科、口腔科等。二次曝光的成功,促成了全息測量技術的發展,20世紀70年代出現的超聲全息技術,將全息技術推進了一大步。由于超聲可深入人體內部,因而超聲全息可探測人體內部器官,如腸、胃、肝、膽及主胎兒等的生理異常,肢端和關節軟組織的超聲全息成像是極有價值的,超聲全息還有希望應用于腱、肌肉和神經結構的顯示。激光全息醫學診斷術雖然產生的時間不長,但由于它具有種種優點,已越來越為人們所重視,并日益廣泛地應用于臨床。
1.1 全患照相術
全息照相術與一般照相不同,照相是記錄物體信息的一種技術,一般是將物體通過透鏡成像在底片上,底片乳膠只記錄光強(振幅),而不能記錄相位,因而失掉了三維特征。而全息照相底片上不只記錄光強(振幅),也記錄相位(各點間的相互位相關系),也就是記錄物的全部信息,所以稱為全息。
全息照片最早是由英國湯姆遜-豪斯敦公司的:蓋寶攝得。照片的實質是將來自物體的波前和另一個參考波(通常是平面波或球面波)相干涉,底片記錄干涉條紋,將同樣的參考波照射此底片時,可在相應位置重新出現三維物體。
由此可見,全息照相和一般照相具有相同之處,即同樣是記錄物體信息的一種手段,但又有所不同,其特點如下:
(1)因為全息照相記錄的是物體的光波,而不是物體的像,因而用這種底片來觀察物體時,可以變換視點來改變觀察方向,亦即可以從不同的位置來考察物體(而一般照相只是從照相位置觀察物體,即在照相鏡頭處觀察物體)。觀察方向只受到照片尺寸大小的限制。
(2)全息照相不需要透鏡,但需要一個參考波源,如果參考波和再現波采用不同的波長,那么還可以具有放大或縮小的功能。
(3)全息照相具有深度效應(體視效應)。如變換觀察方向時,后面部分可被前面部分遮擋,遠處物體隨著觀察者運動而近處的不動,閃光忽隱忽現等。
(4)普通照相底片能直接看出物體的形狀,而全息照相由于在激光照射下,記錄的是干涉圖樣,所以在普通光線下觀察時,看不到什么物體,而只是灰色的一片,要想見到展現物,必須用再現光照射(目前已制出一種能在普通光照射下再現的全息照片)。
(5)全息片記錄的是干涉條紋,對底片的分辨率要求較高(在參考光和物體之間夾角很小時,可采用分辨率略低些的底片)。因此,稍有振動,就會使照片模糊,故必須采取嚴格的防震措施。
(6)普通相正負片的結果正好相反,而在全息照片中,不論正片還是負片結果一樣。
1.2 全息技術在醫學上的應用
眼全息照相實驗裝置簡圖。激光由半反鏡分成兩束,一束為球面波參考光,另一束通過纖維光束,以球狀通過接觸鏡進入眼球,眼球各部分的反射光和慢射光由瞳孔中央部6mm直徑處射出,經投影透鏡作為物波記錄在全息底版上,激光是氬離子激光器,λ= 0.5145Um P=100mW t=10ms-30ms,眼底網膜上的光亮約為3×10-3J/cm2。重現象可觀察晶體表面、虹膜和視網膜。這樣就能用一張全息照片對從晶體到網膜的眼球各部分自由地進行三維檢測。
為使全息像地再現,必須在再現時地重復參考光。沖洗好的全息片必須放好,誤差一般應小于幾秒弧度,以免發生慧差和相差,再現裝置的示意圖,激光經準直器照亮全息圖片,通過顯微鏡或閉路電視系統觀察實像。全息圖片夾在可以多維微量調整的
定位器上,以作精密定位,調整時在顯微鏡下或電視屏幕上觀察,使失真和像差最小,而成像清晰。
利用全息可以拍到活體眼的角膜、晶狀體和視網膜相片,從而對眼的各層介質進行活體觀察,這是用其它方法難以辦到的眼全息圖,亦可表示出眼內的異物的大小、形狀和位置。
此外,利用激光全息二次曝光法,可對人體各部分進行三維記錄。而根據再現圖上的干涉條紋又可以測量人體器官的變形、內力和振動等。用全息測量矯形手術,前后股骨的髕骨端的變形,以使人工髖關節的形狀達到程度,還可利用二次曝光法分析人體胸廓的變形,以尋找癌變部位和大小,也可對眼底的微循環進行研究,利用超聲全息技術,可以獲得一般照相技術無法得到的體內器官全息像。由于超聲的無損性,因而這一方法被認為是探測人體內臟器官和胎兒的方法。
2 C02醫用激光器在醫學上的應用及改進
2.1 C02醫用激光器在醫學上的應用
隨著激光技術的迅猛發展,激光在醫學上的應用越來越廣泛,激光可作為良好的手術刀用,它不但運用于一切手術開刀,而且具有良好的選擇性,與常規手術刀相比,激光手術的較大特點是失血少,對于某些部位和器官用激光作手術最有優越性。我院購置的C02醫用激光器是上海醫用激光儀器廠研制并生產的YYJG-lA型,該機性能,使用方便,隨機備有燒灼探頭,聚焦鏡頭和散焦鏡頭,不僅能使激光能輸出原光束外,還能輸出聚焦光束和散焦光束,它們分別進行燒灼、燒割和局部照射等治療,有效地應用于皮膚科、婦產科、外科、肛腸科、五官科的治療,治療效果非常顯著。
YYJG-lA C02醫用激光器是以C02氣體為工作物質的分子氣體激光器,主要應用C02分子的振動--轉動能級間的粒子數反轉后受激輻射產生激光,本機激勵泵浦源采用直流高壓電源。從電場獲得高能量的電子較易把輔助氣體的N2分子激發到某一高能態,再與C02分子碰撞,發生能量的共振轉移,把C02分子激發到某一亞穩態的高能級,形成對某一低能級的粒子數反轉。亞穩態高能級的C02分子再受激躍遷到該低能級,釋放10.6um波長的光子,經光學諧振腔的光振蕩光放大后形成C02激光。10.6um波長的C02激光屬紅外波段,熱效應很強,為避免激光管諧振腔兩端反射鏡片及放電管濕度過高,引起反射鏡片及放電管損壞,激光管必須設置水冷系統。
由于C02激光器激勵直流電源電壓較高,電流較大,而激光管本身比較嬌嫩,本機除設有斷水保護裝置外,還設有過電壓、過電流保護裝置。如因各種異常原因,產生工作電壓、工作電流超過額定值或循環水冷系統斷水時,保護裝置立即動作,切斷總電源。
2.2 C02激光器在醫學上的廣泛應用
皮膚科主要應用于尖銳濕疣、扁平疣等的燒割。
外科主要應用:(1)具有止血功能的手術;(2)與內窺鏡結合,在腔內進行手術;(3)采用光敏技術,對腫瘤進行治療;(4)對組織進行焊接;(5)理療與康復治療。
肛腸科主要應用于內外痔、肛裂、肛瘺、息肉及肛周外生殖器尖銳濕疣手術。
在內窺鏡下,用激光可治療的有食管疾病、胃腸疾病,如食管靜脈曲張、食管癌、肺癌、胃息肉、十二指腸潰瘍、胃出血、噴門癌、十二指腸癌、膽管癌、膽管結石、膽道狹窄、結腸癌。
婦產科應用于宮頸糜爛、外陰瘙癢、外陰炎及婦科的各種炎癥等。眼科應用于眼部腫瘤的切除、鞏膜切開及球壁再造術。它還可直接氣化腫瘤。五官科主要應用于鼻炎及咽炎等。
以上C02激光的應用的共同特點是不需要全身麻醉,并發癥少,快速簡便和失血少,易被水吸收,因此穿透力較低,被照射部位升溫很快,對周圍組織損傷較小,適用于切割與氣體化組織。對大腸桿菌和金黃色葡萄球菌有明顯的殺菌作用。
2.3 YYJG-1A激光器的改進
目前的C02激光器共同的缺點就是在手術中產生有毒有害氣體,不僅使手術視野模糊,而且危害醫務人員和患者的健康。有些病人的病變組織在激光氣化過程中產生不少帶有病毒的激光煙塵,病毒隨著激光煙塵的逸 散傳染給醫務人員。雖然利用吸煙機把有毒氣體吸走,但需要一名特別助手,而且麻煩。在婦科燒灼宮頸糜爛時,其缺點尤為突出,陰道內產生的高熱煙塵,不僅影響醫生的操作視線,而且還會造成金屬窺陰器發燙,繼而造成陰道壁燙傷,故必須加接吸煙塵裝置。
2.3.1 加接吸煙塵裝置方法
做一個扁形金屬小吸管,與燒灼探頭(或聚焦鏡頭)并排緊固,金屬小吸管再接上皮管通到室外與吸塵器連接,這樣就能很好地將煙塵吸出到室外。
2.3.2 加接擴照用單開關
該機除有燒灼、燒割用途外,尚有發散擴照功能,僅靠一只腳開關控制出光,在燒灼或燒割治療時,宜用腳開關控制輸出,但如用于治療時(照射時間一般為連續15min左右)靠醫務人員踩腳踏開關控制出光就不甚合適。
改進方法:在腳踏開關兩端關聯一只單開關。在擴照治療時,只須將單開關開啟即可,免去了醫務人員腳踩之勞。但此時特別要注意,在燒灼燒割治療時,單開關應嚴格處于關的位置,絕不允許隨意撥動它,否則會造成激光傷人的危險。
此外,還可以裝置簡易水電極,以免玻璃水電極壞后更換不及時,并提高C02激光器的使用壽命。
分析激光技術的應用:原子干涉激光技術鎖定
1引言
原子干涉儀可以地測量重力加速度和重力梯度[l,2]、牛頓引力常數[:‘一創、地球自轉速率和旋轉速率卜8一以及精細結構常數[0l,在導航、資源勘探、地震監測、大地測量及環境監控等方面具有重要應用前景〔“〕,川。原子干涉儀通常采取三對拉曼光脈沖序列(洲2一7T一對2)對原子波包進行相干操作〔‘2],高功率的拉曼光可讓更多的原子參與速度敏感型受激拉曼躍遷,有利于實現信噪比高的原子干涉儀條紋。研制高功率的拉曼激光器對冷原子干涉儀的實驗研究具有重要意義。注入鎖定技術是提高激光功率同時保持注入光相下勝的有效方法[l“]。半導體激光器注入鎖定時,需將主激光器的輸出光注入到從激光器中,主激光器一般選用窄線寬、單縱模的激光器,從激光器選取功率較大的半導體激光器,當主、從激光器的頻率、偏振匹配時,從激光器可被注入鎖定,此時從激光器的頻率、相位和偏振與主激光器同步,主激光器的輸出功率被從激光器有效地放大。注入鎖定技術的實驗研究已有大量報道,最早實現注入鎖定的是氦氖激光器[l4],后來注入鎖定被應用于二氧化碳激光器115,‘“]。近年來,半導體激光器的應用范圍越來越廣,其注入鎖定技術也有了很大的發展!‘7]。2000年北京大學王曉輝等利用半導體激光器速率方程的兩模式場模型描述了從激光器的注入鎖定理論[l”],2008年實現了垂直腔面發射半導體激光器的注入鎖定[‘”]。經過高頻聲光調制器移頻后的兩個激光場能保持很好的相干性,并避免了注入鎖定過程中的模式競爭,頻率和相位相對穩定,可作為拉曼光用于原子干涉儀。高頻聲光調制器的衍射效率往往較低,調制產生的拉曼光不能滿足原子干涉儀對激光功率的需求。如前所述,注入鎖定技術可實現激光功率的放大,因此將聲光調制技術與注入鎖定技術結合起來是實現高功率拉曼光的新思路。
我們基于聲光調制與注入鎖定技術,開展了用于冷原子干涉儀的拉曼光注入鎖定的實驗研究,實現了高功率的拉曼光。主激光器經過1.5GHz高頻聲光晶體移頻后得到功率分別3mw和4mw的士1級光,分別注入兩個輸出功率為80mw的半導體激光管,實現了兩個從激光器的注入鎖定。兩個從激光器的頻差為3.0GHz,在200MHz頻率范圍內頻差線性變化,功率穩定,滿足冷原子干涉儀的實驗要求。
2實驗裝置實驗原理如圖1所示,主激光器用外腔反饋半導體激光器(ToPtica,DLllo),激光波長為780mn,輸出功率為36mw,主激光通過一個直徑為50mm的大透鏡聚焦到1.5GHz的高頻聲光調制器(BI.ilnrose,GPF一1500一200一780),經過往返兩次調制后的衍射效率可以達到20%。主激光通過聲光移頻后得到士1級衍射光,將70%透過的零級光用全反鏡反射后原路返回,重新通過聲光移頻得到一1級衍射光。微波源(Agilent,E8257C一PSG)驅動聲光調制器,驅動頻率為1.5GHz,因此,士1級衍射光的頻率差為3.0GHz。我們將士1級衍射光(注入光)分別注入兩臺從激光器,從激光器采用自制的半導體激光器,用自主研發的電流控制電路和溫度控制電路控制半導體激光管[z0],用非球面鏡(ThorlabS,c230TME一B)對激光管(ThorlabS,DL741o一205)輸出的激光束進行準直。在注入鎖定過程中,先把注入光與從激光器的輸出光調重合,用波長計觀測從激光器的波長,通過調節從激光器的驅動電流和溫度控制,使從激光器的輸出波長在780nm附近,用三角波掃描主激光器,同時觀察主激光器和從激光器的吸收譜線,通過微調從激光器的電流,將從激光器調節到模式,實現兩個從激光器和兩個注入光的激光模式匹配,此時,兩個從激光器的頻率依賴于主激光器,功率為從激光器自身輸出功率,實現了拉曼光激光功率的有效放大。完成注入鎖定后,將兩個從激光器輸出的激光通過偏振分束棱鏡藕合到保偏光纖,送到原子干涉區。拉曼光的相對光強可以通過入/2波片調節,以消除acStark頻移睜‘]。在冷原子干涉實驗過程中,采用偏振光譜穩頻技術,將主激光器鎖定在”SRb原子的護S!/ZF=3一52P華Fl二2,3的交叉峰上。
3實驗結果當從激光器被注入鎖定后,利用三角波對主激光器進行外腔掃描,可以得到Rb原子的吸收譜線,兩臺從激光器被主激光器經過 1.5GHz聲光調制器移頻后的士1級光分別注入鎖定,主激光器 (masterlaser箭頭標示位置)和士1級光被注入鎖定后的兩個從激光器 (slaverlaserl和 slaverlaserZ箭頭標示位置)的吸收譜線如圖2所示,可以看出,主激光器與從激光器被注入鎖定后的吸收譜線(ssRb原子5251/2,F=3一5“P3/2,F’躍遷)的形狀一致,兩臺從激光器被主激光器經過1.5GHz聲光調制器移頻后分別注入鎖定,從激光器相對于主激光器的頻率分別左、右失諧1.5GHz,由此可以看出兩個從激光器被注入鎖定。兩個從激光器的頻率依賴于主激光器,頻率相差3.0GHz,為““Rb原子超精細結構基態能級的微波躍遷頻率,相位保持相對穩定,同時兩個從激光器相對“SRb原子的DZ線負失諧1.5GHz,實現了大失諧的拉曼光激光系統,可以實現原子干涉儀中波包的相干操作。我們將兩個從激光器的輸出激光進行拍頻,用25GHz快速響應光電二極管(New-foclls1434一25G)進行探測,用頻譜儀觀察到的拍頻信號如圖3所示,在3.035GHz附近的拍頻峰半高寬約為17kHz,信噪比優于55dB. 在主激光器的功率為39.0mw的情況下,拉曼光經過光纖藕合后總的輸出功率為4(i8mw,其中+1級光輸出功率為36.0mw,一1級光為10.8mw,兩束拉曼光的光強比例為1:3.5[al}。用微波源對拍頻信號進行掃描,拍頻信號的頻率隨著微波源的掃描頻率線性變化,如圖4所示,實心圓點曲線為拍頻信號中心頻率變化,中空方塊曲線為拍頻信號的功率隨著微波源掃描頻率的變化關系,可以看出在200MHz的頻率掃描范圍內,拍頻信號的功率保持相對穩定。由于主激光器被正負移頻后注入從激光器,因此拉曼光拍頻信號的頻率是微波源掃描頻率的兩倍,通過拍頻信號的強度可以判斷從激光器是否被鎖定。我們用頻譜分析儀實時監測拍頻信號的頻率和功率,兩個從激光器被注入鎖定長達幾十個小時。
4結論我們利用注入鎖定技術實現了拉曼光的功率放大,克服了用高頻聲光調制器產生的拉曼光功率較低的問題,在原子干涉儀實驗中,使更多的原子參與到波包相干操作過程中,提高了冷原子干涉儀的條紋對比度,為冷原子干涉儀在精密測量領域中的應用奠定了技術基礎。
分析激光技術的應用:腔內鈥激光技術在輸尿管結石合并息肉致輸尿管梗阻中的應用
作者：周開華，石否，劉東亮，朱蜀俠，呂健為
【關鍵詞】 輸尿管結石
【摘要】 目的 評價腔內鈥激光技術治療輸尿管結石合并息肉致輸尿管梗阻的療效。方法 自2003年12月始，在腔鏡下應用鈥激光技術治療因結石合并息肉致輸尿管梗阻47例。結果 47例患者中，44例(94％)一次手術成功，另外3例患者中，2例因術中切割息肉過程中結石上移至腎盂，于輸尿管通暢后置雙J管，1周后行體外沖擊波碎石（ESWL），效果較好；1例因輸尿管迂曲成角，上鏡困難，術中改行輸尿管梗阻段（含結石）切除并吻合術。手術平均時間45min(30～90min)，平均住院日6天(5～9天)。47例患者術后3～6個月復查IVP,輸尿管通暢。結論 應用鈥激光經輸尿管鏡治療輸尿管結石合并息肉致輸尿管梗阻是一種安全、有效的微創治療方法，具有避免開放手術、手術時間短、恢復快、創傷小、住院時間短等優點。
【關鍵詞】 鈥激光；輸尿管結石；輸尿管梗阻
近年來，鈥激光技術在泌尿外科領域的廣泛應用，促進了微創外科以及腔內泌尿外科的發展［1］。我院自2003年12月始，在腔鏡下應用鈥激光技術治療因結石合并息肉致輸尿管梗阻47例，均獲滿意效果。報告如下。
1 資料與方法
1.1 一般資料 本組47例患者，男20例，女27例；年齡25～78歲，平均40.3歲。病程1個月～10年，平均10個月。同側腎臟合并結石22例，男8例，女14例。雙側腎臟合并結石15例，男6例，女9例。其中中上段結石30例，下段結石17例。15例曾行體外沖擊波碎石（ESWL）治療。結石最小0.6cm×0.8cm,較大1.8cm×3.0cm,平均0.8cm×1.4cm。術前常規B超檢查示腎臟重度積水，結石以上輸尿管擴張；靜脈腎盂造影示腎臟不顯影或重度積水，結石以上輸尿管擴張，結石以下不顯影；輸尿管逆行插管及造影劑均不能到達結石，中間有充盈缺損，長度為0.5～1.0cm,診斷為輸尿管結石，輸尿管梗阻。
1.2 治療方法 全部病例均在持續硬脊膜外腔麻醉下手術。術前清晨復查KUB確定結石位置有無變化。采用Wolf F8/9.8輸尿管硬鏡，MMC液壓泵，WOLF攝像系統，德國Dormier公司的15W鈥激光系統。麻醉采用高、低兩個不同部位的硬膜外腔麻醉方法，患者取膀胱截石位，常規消毒鋪巾，經尿道直視下插入輸尿管鏡，找到輸尿管開口后，先插入一根Fr3的輸尿管導管，利用液壓灌注泵壓力擴開輸尿管口，同時將鏡體沿軸線旋轉90°～180°入鏡，進入輸尿管口后鏡體回復中立位，并調小灌注速度，沿輸尿管導管上行。入鏡至梗阻段輸尿管部位后，置入鈥激光光纖，輸出能量設為1.5J×10Hz,燒灼或切割息肉及增生組織，顯露結石后再行碎石治療。碎石后再次燒灼或切割息肉，使輸尿管鏡通過順利。術后常規放置7或8Fr的雙J管4～8周。
2 結果
47例患者中，44例(94％)一次手術成功，另外3例患者中，2例因術中切割息肉過程中結石上移至腎盂，于輸尿管通暢后置雙J管，1周后行ESWL，效果較好；1例因輸尿管迂曲成角，上鏡困難，術中改行輸尿管梗阻段（含結石）切除并吻合術。手術平均時間45min(30～90min)，平均住院日6天(5～9天)。47例患者術后3～6個月復查IVP,輸尿管均通暢。
3 討論
尿路結石是泌尿外科的常見疾病，傳統的開放手術治療尿路結石已逐漸被腔內泌尿外科技術所取代，包括ESWL、氣壓彈道經輸尿管鏡碎石排石術、經皮腎造瘺取石術(PCNL)，甚至可使用腹腔鏡輸尿管切開取石術。但被炎性息肉包繞的結石引起輸尿管梗阻為上述腔內碎石手術禁忌，多通過開放手術處理。鈥激光技術在泌尿外科中的應用，使其通過腔內治療成為突破。鈥激光是一種高能脈沖式固體激光，其波長為2140nm，脈沖時間為0.25ms，遠遠小于組織的熱傳導時間(1ms)，故對周圍組織熱損傷極小，當鈥激光照射組織時，可以瞬間達到高溫，引起被照射組織局部迅速汽化切割和凝結，對生物組織的穿透度很淺，僅為0.44mm，組織切除發生在表面，熱損傷區域為0.5～1.0mm范圍內，止血效果好，使得鈥激光成為的泌尿軟組織切除理想工具。同時鈥激光具有非常的碎石能力，碎石過程中，結石表面的水和結石中的水吸收了鈥激光的能量后汽化形成小球，汽化小球隨后裂解所形成的沖擊波產生二次壓力，使結石粉碎，這樣就可以高效粉碎各種成分的泌尿系結石［2］。
對輸尿管結石伴明顯息肉包裹而管腔阻塞者，術前檢查中應明確輸尿管結石合并息肉致輸尿管梗阻的長度和遠近端的方向。對于梗阻段<1cm者，我們選用腔內鈥激光技術治療，始終在輸尿管鏡直視下操作。首先用鈥激光沿梗阻段輸尿管方向在輸尿管中心切割息肉和組織，邊切割邊尋找正常通道，切割時要保持視野清晰，避免可能形成假道或致輸尿管穿孔，發現結石后行碎石治療，這樣首先明確正確的通道方向，然后再切割及消融輸尿管內多余組織及息肉，使輸尿管鏡順利通過。在導絲引導下置入雙J管一根，保留4～8周。患者一般5～7天出院。對于輸尿管上段結石在碎石時還應注意降低或者關閉沖水，并調整患者體位為頭高腳低位，可以減小結石移位腎臟的可能性，對于輸尿管上段結石術中移位腎臟者，可經ESWL治療后排除結石［3］。
通過本組病例治療實踐，筆者體會：（1）應用鈥激光經輸尿管鏡治療輸尿管結石合并息肉致輸尿管梗阻是一種安全、有效的微創治療方法，具有一次性碎石率高、手術時間短、恢復快、住院時間短等優點［4］。（2）應用鈥激光經輸尿管鏡治療輸尿管結石合并息肉致輸尿管梗阻，由于其組織穿透度＜0.5mm,在內鏡下可治療，視野清晰，出血少，安全無嚴重并發癥。（3）鈥激光為脈沖式激光，瞬間峰值功率高達10kW,具有極佳的切割、汽化和碎石功能，能有效地切除息肉或瘢痕后，再行碎石治療，效果較好。（4）鈥激光治療輸尿管結石療效好，90％以上的患者可經鈥激光成功粉碎結石及其他治療。但碎石成功與否的最終決定因素并不是激光本身，而是其他因素：如結石大小和位置、是否因解剖變異或輸尿管狹窄而存在結石通過困難等［1］。本組病例中未成功3例，均為上述因素引起。隨著腔內泌尿外科技術及鈥激光技術本身的不斷改進，相信鈥激光在泌尿外科領域將會得到更多、更廣泛的應用［5］。
分析激光技術的應用:應用激光捕獲顯微切割技術制備肺癌蛋白質組學研究樣品
作者：田應選 南巖東 楊拴盈
【摘要】
目的 探討應用激光捕獲顯微切割(laser capture microdissection, LCM)技術獲取高同質性肺癌組織細胞及正常對照肺泡上皮細胞的方法及可行性。方法 將新鮮肺癌組織標本及其配對正常組織常規制備8μm冰凍切片，采用改良的HE方法染色；應用LCM技術大宗切割肺鱗癌、腺癌及正常對照肺泡上皮細胞；選擇性獲取同質肺癌細胞和配對正常細胞。結果 通過LCM技術可以、快速地分離癌細胞、間質及其他壞死組織，得到同質性不低于95%的腫瘤細胞和正常細胞。按照Duration 15.5s的激光脈沖頻率和平均8000 shots條件，既可保障每個帽子的細胞收集數量，也能夠有效地縮短實驗時間，提高實驗可控性，從而使操作過程標準化。結論 應用LCM技術可以成功獲取同質肺癌細胞和正常細胞。其所需標本量少、組織同質性高、操作過程穩定、可控性好，是肺癌分子生物學及蛋白質組學研究有價值的樣品制備方法。
【關鍵詞】 激光捕獲顯微切割；肺癌組織；蛋白質組學
蛋白質組學是當今腫瘤學研究領域中的一個熱點，而“差異”蛋白質組學又是蛋白質組學研究的一個突破口。在有關“差異”的研究中，若原始樣品不是分別來自同一類型，或樣品存在著雜質蛋白的污染，那么所得實驗數據的性和說服力必然會受到影響[1]。眾所周知，人體組織器官是多種細胞的復合，腫瘤組織的不均一性是腫瘤細胞的重要特征。因此，如何從復雜、不均一的樣品中獲得理想的高同質性的組分成為實驗中亟需解決的主要問題之一。激光捕獲顯微切割(laser capture microdissection, LCM)技術的出現為上述問題提供很好的解決方案。該方法的突出特點是能在目視下從樣品中特異挑選同類細胞乃至單一細胞；從而剔除間質細胞和壞死組織及其他可能影響結果分析的雜質成分[2]。本研究應用LCM針對不同類型組織標本，選擇性獲取同質肺癌細胞和配對正常細胞，以期探討該方法在肺癌研究中的技術參數和操作流程。
1 材料與方法
1.1 標本的收集及制備 收集西安交通大學醫學院第二附屬醫院胸外科、陜西省人民醫院胸心外科及陜西省腫瘤醫院胸外科2005-2006年經病理診斷證實的手術切除腫瘤標本12例，其中肺鱗癌6例，肺腺癌6例。正常對照組織為同一患者正常肺組織。12例患者中男性8例，女性4例；有吸煙史者5人，平均吸煙指數1900支/年；腫瘤分期：Ⅰ期2例、Ⅱ期7例(Ⅱ A3例，Ⅱ B4例)、Ⅲ期3例。所有病例標本均在手術室采集，具體操作如下：待組織標本離體后立即切取腫瘤組織，同時切取正常對照組織；4℃冰鹽水沖洗3-5次，將血液沖凈，均勻分割成0.2cm×0.2cm×0.2cm組織塊，分裝于標志清楚的0.5mL離心管中；先置液氮中速凍，后置于-80℃冰箱保存備用。整個標本采集過程耗時控制于30min內。
1.2 試劑和儀器 蘇木精、伊紅、無水乙醇、二甲苯、尿素等均為國產分析純。組織包埋劑(OTC)，冰凍切片機(Microm，HM500)，超低溫冰箱(Thermo Forma -86℃)，Pixcell顯微激光切割系統(Arcturus, USA)及乙烯乙酸乙烯酯膜帽子細胞收集器(EVA LCM Caps)。
1.3 方法
1.3.1 冰凍切片的制備及染色 預處理載玻片(將普通載玻片清洗干凈，流水沖洗后泡酸過夜，雙蒸水沖洗干凈，60℃烘干備用)。取0.2cm×0.2cm×0.2cm大小組織兩塊，OTC包埋，待組織包埋固定，將切片機箱內溫度設置為-25℃進行切片，切片厚度8μm，每次連續制作15張切片，-80℃保存備用。兩組腫瘤組織和對照各6例，每例患者制作切片15張，進行HE染色，方法如下：蘇木精10s，撈片置于冰水沖洗10s，伊紅15s，85%、95%(體積分數)乙醇各20s，無水乙醇2min，2次，二甲苯Ⅰ 2min，二甲苯Ⅱ 2min。上述染色過程在冰盒中進行，染液溫度控制于4-10℃，總時間控制在10min以內。完畢后進行激光捕獲。
1.3.2 激光捕獲 將染色完好切片置于Pixcell顯微激光切割系統10×10倍目鏡直視觀察，重點觀察細胞形態和染色情況。找到細胞密集、形態較好、染色滿意區域，裝載細胞收集器；在10×20倍目鏡下調節監視器，按照如下條件：Power 100mV、Duration 15.5s、Spots size 15.5μm、Current 8.0mA，每張切片平均8000 shots條件進行捕獲。總捕獲時間不超過40min。
2 結果
切片按照改良的HE方法染色后，均能獲得細胞形態完整、對比度好、腫瘤細胞和間質可清楚區分的合格切片。在設定捕獲條件下，每張切片捕獲后能夠將90%以上的細胞收集，細胞同質性高(圖1)。按照理論測算，每個shots可以捕獲4-6個細胞，即每個帽子收集裝置可以獲得25000-30000個細胞數。總體捕獲結果見表1。
3 討論
肺臟是一個開放器官，容易受到外界污染，加之肺癌組織含有較多間質細胞而且容易壞死，因此，按照傳統方法進行組織塊研磨提取總蛋白進行分析，結果難免會受到雜質蛋白的影響。LCM技術現已成為蛋白質組學研究中獲得純化的目的細胞的理想工具，其在實體瘤研究中應用較多，技術方法亦日臻成熟[3?5]。但據文獻報道，該方法主要用于核酸分子以及染色體研究，在肺癌組織蛋白組學研究領域鮮見[6]。本研究應用LCM技術切割不同類型肺癌組織，獲得250個帽子收集裝置和8.7×106個細胞數。從捕獲操作過程中我們發現，捕獲細胞的同質性、細胞收集率以及操作過程所耗費時間是影響激光捕獲及后續蛋白質組學實驗結果的關鍵因素。由于LCM是在直視下操作，細胞純度可以保障。經隨機抽取3組、45個帽子收集裝置，使用Pixcell II顯微激光切割系統內標記尺劃分觀察視野，抽樣估算收集裝置內細胞同質性可達到95%以上，該結果與文獻報道一致[7]。當然，文獻報道最多的是關于基因和分子水平的研究，但其中的切片制作和LCM切割部分是相同的。Pixcell II顯微激光切割系統是新一代系統，該系統的優點是使用的是乙烯乙酸乙烯酯膜的塑料帽(ethylene vinyl acetate caps, EVA caps)細胞收集裝置，可避免操作者手接觸所收集到的細胞，減少污染機會。EVA膜需要和細胞緊密接觸才能夠被激光束融化而將目標細胞收集，因而LCM過程受很多因素影響而不能保障將每個捕獲細胞均能收集。激光捕獲儀主要參數有：Power、Duration、Spot size、Repeat及Current等。一般在打開系統進行切割之前，應先在帽子空白區空打5-6次，觀察激光能量，光點大小是否合適，以光點能夠覆蓋目標細胞為宜。本實驗中所選擇條件是：Power 100mW、Duration 15.5ms、Spot size 7.5-15μm、Repeat 0.2s、Current 8.0mA。Zhukov等[8]應用LCM切割肺癌組織時認為，鱗癌可選擇7.5μm激光束，腺癌中用15μm，可獲得較好效果。在本實驗中，我們發現激光束的大小與鱗癌和腺癌組織類型關系不明顯，但與切片的制作和捕獲操作過程關系較大，切片的厚度、脫水時間和EVA膜是否和細胞緊密接觸是重要影響因素。制作切片時應將切片厚度控制于8-9μm，以8μm效果，超過10μm因切片過厚則細胞發生重疊從而使細胞收集困難，同時要注意不能使切片產生褶皺，造成切片表面與EVA膜之間存在縫隙，影響捕獲效果。在HE染色步驟中，二甲苯疏松時間、組織含水量及環境濕度等均可影響捕獲結果。二甲苯疏松時間不足細胞較難從周圍組織分離。對環境濕度和組織含水較多者應及時更換染液，適當延長乙醇的脫水時間。但過分延長脫水時間則使組織變的干燥松脆，出現帽子與切片不能緊密接觸而無法捕獲。在實驗過程中梯度乙醇的最長脫水時間為2min。乙烯乙酸乙烯酯膜的塑料帽(EVA caps)應置于4-10℃、干燥環境妥善保存。如帽子受潮，則激光激發能量可被乙烯乙酸乙烯酯膜大部分吸收而非穿透，致使帽子與組織接觸局部溫度升高，產生組織和捕獲細胞灼傷。從腫瘤組織類型看，腺癌的捕獲收集成功率較高，可以達到91%；鱗癌相對較差，可能與鱗癌多有癌巢及角化珠形成、癌細胞與間質結合較為致密有關。考慮到正常肺泡及支氣管上皮細胞體積相對較小、細胞分布相對稀疏，故正常對照組應多捕獲約10個帽子，以保障病例和對照之間可溶性蛋白總量的均衡性。在所有蛋白質組學實驗中，標本處理時間都是有嚴格要求的[9]。一般認為，組織標本超過30-40min常溫暴露往往造成細胞內蛋白質大量降解而影響檢測結果。在本實驗中，我們使用改良的HE染色方法，較標準方法時間縮短14min，明顯減少組織暴露時間。但從染色效果看，該方法對細胞核染色效果不佳、核漿的對比度較差；而且在腺癌染色效果與鱗癌和正常組織有所不同，其原因有待深入研究。有學者在乳腺癌等實體瘤標本中使用蘇木精單染，其染色時間在30s[10]。我們在預實驗中使用該方法發現，盡管用蘇木精染色后時間可縮短，避免蛋白質降解，但隨著捕獲時間的延長，切片染色加深，導致細胞和間質不能很好區分，影響捕獲效果。在LCM操作過程中將捕獲時間控制在40min內，按照統一標準：Duration 15.5s的激光脈沖頻率和平均8000 shots計算，既可保障每個帽子的細胞收集數量，也能夠將實驗時間盡可能縮短，從而使實驗可控性提高使操作過程標準化。當然，從質譜分析的角度出發，通過LCM獲取細胞的數量較小是該方法不可避免的缺陷[11]。因此，在后續實驗中，選擇適當的質譜方法應當慎重考慮。